目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量
RT-PCR法(QuantitativeReal-timePCR)分為染料法和探針法，染料法以SYBRGreen法為代表，SYBRGreen染料游離時(shí)熒光微弱，但但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系，因此可以通過檢測熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA(PCR產(chǎn)物)的量，但該方法沒有特異性，非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。對于探針法來說，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度也是檢測PCR產(chǎn)物量的依據(jù)。但其發(fā)光機(jī)制卻與染料法*不同。
SYBRGreen檢測模式是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光大增強(qiáng)。因此，SYBRGreen的檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。由于SYBRGreen沒有特異性，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會(huì)結(jié)合發(fā)光，對PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，所以在臨床上使用可能會(huì)有假陽性發(fā)生。SYBRGreen的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制不同的，這對科研是很有利的。
RT-PCR法的技術(shù)原理是采用雙重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合，針對樣品的特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過監(jiān)測不同熒光通道的熒光信號(hào)變化，檢測MTB感染。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便易行等優(yōu)點(diǎn)。大量研究顯示，RT-PCR技術(shù)在標(biāo)本快速診斷中具有重要的臨床價(jià)值。
關(guān)于RT-PCR法的兩種熒光定量檢測就是就到這里了，希望看完這篇文章能對你有所幫助！
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