目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量
RT-PCR法(QuantitativeReal-timePCR)分為染料法和探針法,染料法以SYBRGreen法為代表,SYBRGreen染料游離時(shí)熒光微弱,但但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后,熒光大大增強(qiáng),反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系,因此可以通過檢測(cè)熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA(PCR產(chǎn)物)的量,但該方法沒有特異性,非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。對(duì)于探針法來說,反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物量的依據(jù)。但其發(fā)光機(jī)制卻與染料法*不同。
SYBRGreen檢測(cè)模式是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光大增強(qiáng)。因此,SYBRGreen的檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。由于SYBRGreen沒有特異性,不能識(shí)別特定的雙鏈,只要是雙鏈就會(huì)結(jié)合發(fā)光,對(duì)PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光,所以在臨床上使用可能會(huì)有假陽(yáng)性發(fā)生。SYBRGreen的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生,由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合,所以對(duì)不同模板不需特別定制不同的,這對(duì)科研是很有利的。
RT-PCR法的技術(shù)原理是采用雙重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合,針對(duì)樣品的特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針,通過監(jiān)測(cè)不同熒光通道的熒光信號(hào)變化,檢測(cè)MTB感染。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)。大量研究顯示,RT-PCR技術(shù)在標(biāo)本快速診斷中具有重要的臨床價(jià)值。
關(guān)于RT-PCR法的兩種熒光定量檢測(cè)就是就到這里了,希望看完這篇文章能對(duì)你有所幫助!