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鰓霉屬通用PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)反應(yīng)五要素

點(diǎn)擊次數(shù):578 更新時(shí)間:2020-04-02
 
  鰓霉屬通用PCR試劑盒反應(yīng)五要素:
 
  參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
 
  引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
 
 ?、僖镩L(zhǎng)度: 15-30bp,常用為20bp左右。
 
 ?、谝飻U(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
 
 ?、垡飰A基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
 ?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
 
 ?、菀?'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
 
 ?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
 
 ?、咭锏奶禺愋裕阂飸?yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
 
  引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
 
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