CRISPR的工作基本原理
目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)有三種不同類型即I型、II型和III型，它們存在于大約40%已測序的真細(xì)菌和90%已測序的古細(xì)菌中。其中II型的組成較為簡單，elisa試劑盒免費(fèi)代測以Cas9蛋白以及向?qū)NA(gRNA)為核心組成，也是目前研究中zui深入的類型。
當(dāng)細(xì)菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時(shí)，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長的RNA前體(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，zui終識(shí)別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。
在II型系統(tǒng)中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9單獨(dú)參與。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白質(zhì)中部的HNH2個(gè)*的活性位點(diǎn)，elisa試劑盒免費(fèi)代測在crRNA成熟和雙鏈DNA剪切中發(fā)揮作用。此外，pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，與其重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來，并且激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNase III核酸酶對pre-crRNA進(jìn)行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復(fù)合體，識(shí)別并結(jié)合于crRNA互補(bǔ)的序列，然后解開DNA雙鏈，形成R-loop，使crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9中的HNH活性位點(diǎn)剪切crRNA的互補(bǔ)DNA鏈，RuvC活性位點(diǎn)剪切非互補(bǔ)鏈，zui終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。CRISPR／Cas9的剪切位點(diǎn)位于crRNA互補(bǔ)序列下游鄰近的PAM區(qū)(Protospacer Adjacent Motif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征區(qū)域中的NGG位點(diǎn)，而這種特征的序列在每128bp的隨機(jī)DNA序列中就重復(fù)出現(xiàn)一次。研究結(jié)果表明，Cas9還可以剪切線性和超螺旋的質(zhì)粒，elisa試劑盒免費(fèi)代測其剪切效率堪比限制性內(nèi)切酶。
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