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PCR反應(yīng)所需細(xì)菌DNA 模板的制備

點(diǎn)擊次數(shù):1259 更新時(shí)間:2012-08-28
 

PCR反應(yīng)所需細(xì)菌DNA 模板的制備

從分析的標(biāo)本中純化核酸,即制備PCR反應(yīng)的模板,是使PCR獲得成功的重要的*步。由于PCR的用途各異,用于抽提核酸的起始材料種類可能差異很大(包括新鮮的、儲(chǔ)存的和古代的)。每種特殊樣品類型有各自的限制和抽提核酸的不同要求,但它們都有一個(gè)共同的標(biāo)準(zhǔn),擴(kuò)增的靈敏性要求特別注意不同材料、PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒或?qū)φ罩g可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高度純化的核酸,為zui大限度材料污染的機(jī)會(huì),可以使用快速而且簡便的提取方法。

【試劑與配制】

TE緩沖液(pH8.0)

裂解緩沖液:2%SDS,10μg/ml蛋白酶K溶于TE中。

RNase A (10mg/ml)

平衡酚

:(24:1)

無水乙醇

70% 乙醇

3mol/L 乙酸鈉(pH5.2)

【操作方法】

1、方法一

(1)從平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量離心管中,加入400μl裂解緩沖液,混勻;

(2)55℃~60℃,水浴15~20min;

(3)加入等體積的酚::(25:24:1),混勻;

(4)5000g離心10min;

(5)吸取上層水相,再加入等體積的:(24:1);

(6)重復(fù)(3)~(4);

(7)吸取上層水相,加1/10體積3mol乙酸鈉及RNase A(終濃度為0.25~0.3μg/μl),輕搖,37℃保溫30 min;

(8)加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇,-20℃ 2hr;

(9)10,000g 離心15min,棄上清,或用無菌細(xì)玻棒攪?yán)p出DNA;

(10)70% 乙醇洗2次,待乙醇蒸干后重新溶于小體積去離子水或TE緩沖液中(約20μl)。一次取5~10μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2、方法二

(1) 取一定數(shù)量的細(xì)菌加入500μlTE緩沖液中;

(2) 100℃煮沸10min,置冰浴保存;

(3) 10,000rpm,4℃離心10min;

(4) 取適量上清作為PCR 模板。

3、方法三

(1) 制備一定濃度的細(xì)菌/去離子水懸液,反復(fù)凍融3次;

(2) 10,000rpm,4℃離心10min;

(3) 取適量上清作為PCR 模板。

 
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